JCまとめ:K宮

A novel lysophosphatidylcholine acyl transferase activity is expressed by peroxiredoxin 6
Aron B. Fisher, Chandra Dodia, Elena M. Sorokina, Haitao Li, Suiping Zhou, Tobias Raabe, and Sheldon I. Feinstein
Journal of Lipid Research, 2016 Apr;57(4):587-596

 この論文では、Prdx6のLysophosphatidylcholine Acyl Transferase (LPCAT)活性について論じています。先行研究において、Prdx6はリン脂質からsn-2位の脂肪酸と取り去るPLA2活性を持つことが報告されています。この活性は細胞膜リン脂質の修復や、肺胞でのDipalmitoyl Phosphatidyl Choline(DPPC, 肺胞の柔軟性を保つ主な要素)の産生に重要とされてきました。筆者らは、Prdx6のアミノ酸配列にLPCAT motifが含まれることに着目し、Prdx6がリゾリン脂質への脂肪酸付加を触媒するLPCAT活性を持つという仮説で研究を進めています。
 Fig.3-6とtable.3-5では、RIにより標識したリゾリン脂質と補酵素を試験管内で反応させ、Prdx6のLPCAT活性の性質を探っています。この結果、リゾリン脂質と補酵素CoAからリン脂質が生成され、Prdx6がLPCAT活性を持つことが示されました。また、pH条件とPrdx6のリン酸化が活性を変化させることも明らかになりました。pHは7から4へと酸性に傾くことで活性が約3倍上昇し、リン酸化はpH4で約10倍、pH7で約30倍活性を高めます。またこの活性は、CI-976という阻害剤により特異的に阻害できることが分かりました。さて、このLPCAT活性を既報のPLA2活性と比較すると、反応の指標であるKm, Vmaxは既報のPLA2反応の値より高くなっています。また、リゾリン脂質産生(PLA2活性)と脂肪酸付加(LPCAT活性)の2つの反応が、基質と離れることなく連続的に起こることを示唆しました。
 最後に筆者は、Peroxidase活性, PLA2活性, LPCAT活性に関与するアミノ酸配列について検討しています。各活性を司るドメインについて1塩基置換を生じたサンプルを用い、PLA2活性とLPCAT活性の双方を測定しました。このうち、H26はcatalytic triad(PLA2活性)とLPCAT motifの重複部位ですが、変異体ではLPCAT活性は失われませんでした。そこで、LPCAT motifの他の部位であるD31の変異体を測定したところ、LPCAT活性は有意に減少しました。このことから、LPCAT活性には特にこの部位が重要であることが示されました。
 以上より、Prdx6はLPCAT活性を実際に持つことが実証され、その活性にはPLA2活性との類似や連携があることが示唆されました。PLA2活性とLPCAT活性を1つの酵素が併せ持つことは稀であり、6つのアイソフォームがあるPeroxiredoxinの中でもPrdx6はユニークな存在と言えます。


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# by Fujii-group | 2017-06-15 15:11 | ラボミーティングの内容 | Comments(0)

夏の蒸し暑さが顔を覗かせ始め、自転車通学の私にとっては汗との闘いが始まりました。今春より修士課程に進学し、藤井研3年目を迎えた小宮です。

2017年も折返しの月に入り、藤井研最大のイベントであるシークレット・サンタから半年が経とうとしています。このイベントでのプレゼントは、各人のラボ生活に役立つものの場合も多く、それらはしばしばラボやデスクに飾られます。かく言う私も、「日々の癒しに」とI上さんから(?)頂いた多肉植物を机に置いています。春先には私の飼育ミスにより危うく枯らすところでしたが、今は見事に回復し、日に日に新芽を伸ばしています。
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※冬の写真がないため比較できませんが、上部の葉が小さい部分は今春伸びてきた部分です。

I上さん(?)デザインの鉢植も窮屈になってきたので、そろそろ株分けしようと考えています。株分けは手順を誤ると全滅するそうなので、プロトコールを順守し慎重に行おうと思います。
ところでI上さん、学生最後のラボブログ待ってます。

さてI上さんやM藤さん, 秘書のM田さんが卒業された春でしたが、我々(H口と私)も送別会にてUSBメモリのプレゼントを頂いたのでした。USBメモリーは、居室と実験室が分かれた構造の藤井研において、実験データを持ち運ぶのに不可欠です。一方でUSBメモリーには、「紛失し易い」という欠点があります。現に学生課にはUSBメモリーの忘れ物が毎日報告されており、その中のデータは流出のリスクと隣り合わせです。
そんなUSBメモリーの欠点を解消したのが、私が藤井研で初めて実験を教えて頂いたM田さん(14年度修了)の発明です。M田さんは、細胞を用いた実験で必ず身に着けていた髪ゴムにUSBメモリーを括り付け、この欠点に打ち勝ったのでした。藤井研では貴重な実験データを守るため、この発明を確実に後輩へと受け継いでいます。
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P.S 情報科目のTA(PC教室の忘れ物管理も業務)をしている私から加えますと、USBメモリーに学修番号などを書いておくと、大学内で紛失しても戻りやすいです。個人情報の類を書くのは、道端で紛失した際にデータと個人を結びつける悪用の糸口になるので、注意が必要です。


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# by Fujii-group | 2017-06-01 17:38 | メンバーの日記 | Comments(0)

JCまとめ:M田

‘’Myogenic Progenitor Cells Control Extracellular Matrix Production by Fibroblasts during Skeletal Muscle Hypertrophy’’
C. S. Fry, T. J. Kirby, K. Kosmac, J. J. McCarthy, C. A. Peterson
Cell Stem Cell, Vol.20, Issue 1, 5 January 2017, Pages 56–69

今回の研究は、活性化したサテライト細胞がmicroRNAを含んだエクソソームを分泌し、筋組織に存在する線維芽細胞の線維新生を抑制しているというものです。
過負荷による筋肥大の際、サテライト細胞がない状態では、サテライト細胞がある場合よりも、筋肥大が減弱し、線維化がおこるという現象が著者らの先行研究で観察されました。これに加えて、初代培養による筋芽細胞(MPC)の培養上清を同じ筋から得られた線維芽細胞(Fb)に添加すると、Fbのコラーゲン遺伝子群の発現が抑制されるということも観察されました。これらの点を踏まえ著者らは、サテライト細胞が何か液性因子を分泌することで線維化を抑制し、筋肥大がおこりやすい環境をサテライト細胞が整えているのではないかという仮説をたてました。
今回採用した筋肥大をおこす方法は、手術によりマウスの下肢筋の一部を除去し、残した筋部位に代償的な負荷をかけ、残した部位を過負荷によって筋肥大させるというやり方です(SA)。また、サテライト細胞の除去は、薬剤投与によってサテライト細胞特異的にジフテリア毒素が作用させ、サテライト細胞を細胞死へ導くという遺伝子組み換えマウス(SC-Dep)を用いて行いました。
はじめに、線維化が生じるにあたり、サテライト細胞が存在しないことで線維芽細胞の数が増加していないかどうかの確認を行いました(Fig.1)。SA二週間での組織切片の結果より、SAによるTcf4陽性細胞(Tcf4:線維芽細胞のマーカーの一つ)の増加が確認されたものの、サテライト細胞の有無による増加への影響は確認されませんでした。また、線維芽細胞において線維新生を促進する経路とされるTGF-βとSMADの経路もサテライト細胞の有無による変化はありませんでした(Fig.S2)。
線維芽細胞の数や線維化を促す経路に変化がないにも関わらず、サテライト細胞が無いことでSAにより線維化が生じる原因を探るため、著者らは先行研究でのMPCの培養上清でFbのコラーゲン遺伝子群の発現が抑制された結果に注目しました。今回の研究ではMPCの培養上清からエクソソームを抽出しFbに添加して培養すると、Fbのコラーゲン遺伝子の発現が抑制されることが明らかとなりました(Fig.2)。また、MPCの培養上清から抽出したエクソソーム内の核酸を染色し、Fbに添加すると染色した核酸がFb内に移行していることが観察されました(Fig.2)。これらのことから、著者らはmicroRNA(核酸)を含んだMPCからのエクソソームがFbに取り込まれ、Fbのコラーゲンを翻訳抑制していると考えました。
MPC、MPCからのエクソソームおよびFbのmicroRNAを網羅的に定量したところ、MPCとMPCのエクソソームに存在量が多く、Fbで少ないというmiR-206が見つかりました(Table 1)。miR-206の標的遺伝子をWebツール(TargetScan)によって検索したところ、コラーゲン新生の制御因子であるRrbp1が候補にあがりました。そこで、FbにmiR-206を強制的に導入し、Rrbp1のタンパク質発現量を確認したところ、Rrbp1の発現量が減少していることが確認されました。また、これに連動してコラーゲン遺伝子群のmRNA発現も減少していました(Fig.3)。Rrbp1の減少は、MPCのエクソソームをFbに添加して培養した際にも確認されています(Fig.3)。加えて、Rrbp1のmiR-206認識配列を用いたルシフェラーゼアッセイの結果からmiR-206がRrbp1の翻訳抑制をしていることも確認されました(Fig.S3)。一方で、miR-206の相補鎖を導入してmiR-206の活性を抑制すると、Rrbp1のタンパク質発現が亢進し、コラーゲン遺伝子群のmRNAの発現も上昇するという結果も確認できました(Fig.3)。以上のことからin vitroの実験においてMPCのエクソソーム内のmiR-206がFbのRrbp1の翻訳抑制をおこし、コラーゲンの新生を抑制していることが示されました。
著者らはin vitroで確認された現象がin vivoにおいても生じているかどうか確認を行いました。サテライト細胞がある状態(SC-WT)ではSA二週間において、筋組織内でmiR-206の発現が上昇しているが、SC-Depにおいては上昇が確認されませんでした(Fig.4)。反対にSC-WTで発現が抑制されているRrbp1タンパク質やコラーゲン遺伝子群のmRNAはSC-Depで発現が上昇していました(Fig.4)。実際にSC-DepでSAを8週間経験した筋組織では線維質がSC-WTにくらべ増加していることが確認されました(Fig.5および先行研究)。
しかしながら、SAを一週間経験した後に薬剤投与によってサテライト細胞を除去すると、線維化ならびに筋肥大の減弱は生じませんでした(Fig.5)。これについて著者らは、細胞外基質の制御においてサテライト細胞は、過負荷による筋肥大の初期(一週間前後)において重要であり、それ以降はサテライト細胞を介さない別の制御機構があるのではないかと言及しています。
以上を踏まえ、著者らは過負荷による筋肥大の初期(一週間前後)において、サテライト細胞は線維芽細胞に向けてmiR-206を含んだエクソソームを分泌しており、届いたmiR-206がRrbp1の発現抑制を介して線維芽細胞からの過剰な線維新生を抑制し、筋肥大の妨げとなる線維化を防いでいるというモデルを提唱しました。
今回の研究に対する懸念点としては、①SAが普段の筋肥大を本当に再現しているのかという点、②MPCとFbの分離方法に曖昧さが残る点、③サテライト細胞からの分泌という提唱において、in vitroの実験でしか確認されておらず、in vivoで本当にサテライト細胞に由来するmiR-206が線維芽細胞に作用しているのか確認ができていない点などがあげられます。
サテライト細胞の減少(消失)が線維化を引き起こしているとするデータから、加齢によるサテライト細胞の減少との関連等について気になりましたが、これについてはDiscussionで一言述べられている程度でした。


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# by Fujii-group | 2017-05-26 08:34 | ラボミーティングの内容 | Comments(0)

はじめまして。
今年度から副専攻の研究でお世話になります、H田です。

わたしがこちらの研究室を選んだのは、今年副専攻で研究したことを来年の卒研でも生かせる研究室に行きたいと思ったからです。

わたし自身は運動は全く得意でなく、むしろ苦手な方です。スポーツは完全にやるより観る派です。
でも、スポーツ観戦は行ったことはないですが興味はあります。誰かサッカーや野球に詳しい人に連れて行ってほしいです。
部活は中高大と吹奏楽部で、気がつけば今年で9年目に突入しました。我ながら長いと思います。辞めどきがわからなくなってきました。

特徴として、かなりよく食べます。食べ放題に行くといつも時間が足りません。都会の食べ放題はなぜみんな70分や90分しかないのでしょうか。笑
お酒もそこそこ強い方です。最近ビールが飲めるようになって大人になったなあと実感しています。

それから、イベントごとも大好きなので、こちらの研究室では研究だけでなく季節ごとの行事も今からとても楽しみにしています。
今年の副専攻生はわたしだけなので同期がいないのは少し寂しいですが、その分周りの先生方、先輩方からたくさんのことを学び、実り多い年にしていけるよう精一杯頑張ります。
宜しくお願い致します。


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# by Fujii-group | 2017-05-18 19:00 | メンバー紹介 | Comments(0)

新人の自己紹介:J.Cさん

はじめまして、自己紹介が遅くなりました、今年度卒研生としてお世話になっておりますJ.Cと申します。先輩方のように名前を「ローマ字+漢字」の表記で書きたいところですが、私の苗字が一文字であるため、「下の名前ローマ字+苗字ローマ字」で書かせていただきました。何故間に「.」をいれたのかというと、単純にJCと区別したかっただけでした。

私は一年生の時藤井先生の授業を受け、二年生で副専攻の履修を考えていた時この研究室を知りました。人間健康科学について関心があり幅広く学びたいと思い、副専攻は公衆栄養学で、卒研はここを選びました。現在はマイオカインに関しての課題を進んでいて、早くメンバーの役に立てるよう頑張ります。

小学校から高校まで学校のオーケストラでバイオリンをやっていました。大学に入りバイオリンは実家に置いてきたのでブランクはありますが実家に帰る度練習して経験を積んでいます。この影響もあり、クラシックが大好きです。オーケストラで一番好きな曲はThe Phantom of the Operaとアントニン・ドヴォルザークのCarnival, Op. 92です。現在オペラにもはまっていて、劇団四季様の「オペラ座の怪人」横浜公演も先日観劇しました。迫力があってとても素晴らしかったです。

私はいざやるときはテキパキやるタイプだと思うのですが、何故か眠気があるときはホントに眠気に勝てなくてずっと悩んでいます。コーヒー、目薬、洗顔、ガム……色々試しましたが効果抜群には至らず……今は同じ卒研生の勧めでメガシャキという香辛料を含む炭酸飲料をモニタリング中です。もし他に眠気に勝てる良い方法がありましたら教えていただければ幸いです。

研究室に来て一ヶ月経ち至らぬ点も多々あるかと思いますが、何卒宜しくお願い致します。


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# by Fujii-group | 2017-05-15 22:09 | メンバー紹介 | Comments(0)

分子生物学、運動生化学、生理学研究、の日々
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