M田君 JCまとめ

mTORC1 and muscle regeneration are regulated by the LINC00961-encoded SPAR polypeptide
Nature 541, 228–232 (12 January 2017)

今回の論文は、タンパク質として翻訳されないと考えられていたNon-cording RNA(LINC00961)から、ポリペプチド(SPAR)が翻訳されており、それがmTORの経路を抑制して筋再生を負に制御していたという内容の論文です。

RNAとして転写調節や翻訳調節の機能を持つNon-cording RNAですが、最近の研究により一部のNon-cording RNAでポリペプチド(100アミノ酸程度)が翻訳されることがわかってきました。しかしながら、その機能については未解明な点が多く、解析が待ち望まれていました。
著者らは、Non-cording RNAとして報告されている配列の中から、開始コドンを持ち、翻訳される可能性のある配列(LINC00961)を見つけ出し、それが90個程度のアミノ酸として翻訳されていることを見出しました(Ex. Data Fig. 1 & Fig. 1)。また、翻訳されるアミノ酸配列内に膜貫通領域があることが予測されたことから、遠心分離により精製した膜画分のウエスタンブロットによる解析と免疫染色による解析を行ったところ、LINC00961により翻訳されるポリペプチドは、細胞質側にその大部分を突き出しており、N末側で膜に貫通し、後期エンドソームあるいはリソソームに局在することが判明しました(Ex. Data Fig. 2 & Fig. 1)。さらに、後期エンドソーム/リソソームに局在しないタンパク質(CD8)のC末の配列をLINC00961により翻訳される配列のC末と入れ替えると、CD8が後期エンドソーム/リソソームに局在したことから、LINC00961により翻訳されるポリペプチドのC末には、後期エンドソーム/リソソームに輸送されるシグナル配列があることがわかりました(Ex. Data Fig. 2)。
続いて、LINC00961がどんなタンパク質と結合するのかを調べました。LINC00961のC末にFlagタグをつけ、HEK293T細胞に強制発現させた後、Flagで免疫沈降を行い、落ちてきたタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、銀染色により現れたバンドを、それぞれ質量分析(LC-MS/MS)にかけたところ、v-ATPase複合体のサブユニットが一緒に落ちてくることがわかりました(Ex. Data Table 1)。強制発現させた細胞の抽出物をFlagで免疫沈降した結果と、免疫沈降とGSTプルダウンを併用した細胞外でのLINC00961によるペプチドとv-ATPaseサブユニットの結合解析の結果から、LINC00961によるペプチドは確かにv-ATPaseと結合することが確認されました(Fig. 2)。
この結合が実際に、どんな経路に関わっているのかを解析するために著者らは、v-ATPaseとmTORの経路に注目しました。先行研究により、v-ATPaseとmTORC1は、Ragulator-Rag複合体やRhedを介してリソソーム膜上で結合することが報告されています。アミノ酸刺激依存的にRagulator-Rag複合体がv-ATPaseから解離し、解離したことでRagのGTP/GDP変換による活性化が起こり、mTORC1がリソソーム膜上にけん引され、mTORC1の経路がONになるとされています。先行研究を踏まえ、著者らは、LINC00961によるペプチドがmTORの活性を調節するかどうか解析を行いました。HEK293T細胞にLINC00961により翻訳されるペプチドを強制発現させ、mTORの下流にあるS6K, S6, 4EBPのリン酸化をウエスタンブロットに定量しました。すると、LINC00961ペプチドの強制発現により、アミノ酸刺激によるmTORの活性化が抑制されていることが明らかとなりました(Fig. 2)。反対にLINC00961によるペプチドの発現量をRNA干渉により翻訳抑制すると、コントロールよりもmTORの活性化が亢進していることがわかりました(Fig. 2)。また、ミトコンドリア輸送シグナルをLINC00961ペプチドに人為的に組み込み、LINC00961ペプチドをミトコンドリアに無理やり輸送させると、アミノ酸刺激依存的なmTOR経路の抑制が起こらないことがわかりました(Ex. Data Fig. 4)。しかし、このmTOR経路の抑制はアミノ酸刺激依存的な場合に限った反応であり、インスリンやEGF、ロイシン単体、アルギニン単体刺激によるmTOR経路の活性化を抑制することはありませんでした(Ex. Data Fig. 5)。以上より、著者らはLINC00961により翻訳されるペプチドを‘small regulatory polypeptide of amino acids response’ (SPAR)と名付けました。
次に著者らは、SPARがアミノ酸刺激依存的なmTORの活性化をどのように抑制しているのか調べました。アミノ酸刺激によるmTORのリソソームへの移行、Ragの恒常活性型に対するSPARのmTOR経路抑制度合、v-ATPase抑制によるmTOR経路抑制に対するSPARのmTOR経路抑制度合をそれぞれみたところ、SPARの抑制が働くタイミングとして「①アミノ酸刺激→②v-ATPaseとRagulator-Rag複合体の解離→③v-ATPaseによるRagの活性化→④mTORのリソソームへのけん引と活性化」という流れの中の②よりも上流に位置していることがわかりました(Fig. 3)。
以上より著者らは、SPARはリソソーム膜上でv-ATPaseに結合し、アミノ酸刺激依存的なv-ATPaseとRagulator-Rag複合体の解離を妨げ、mTORの活性化を抑制しているのではないかというモデルを立てました(Fig. 3)。
SPARによるアミノ酸刺激依存的なmTOR経路の抑制が生理的にどんな意味を持つのか解析するために、CRISPR/Cas9システムを用いて、SPAR開始コドン欠損マウス(SPAR-/-マウス)を作製しました(Ex. Data Fig. 7)。
先行研究により、mTORの活性が筋再生に重要であることが報告されていることから、著者らは、Spar-/-マウスを用いてCTX(筋損傷を起こすヘビ毒)による筋損傷再生実験を行いました。その結果、筋損傷させたSpar-/-マウスにおいて、損傷7日目で野生型マウスに比べ、損傷により現れる中心核筋細胞の断面積が大きいことが明らかとなりました(Fig. 4)。また、組織免疫蛍光染色により、筋幹細胞数(Pax7)、分化マーカー(Myogenin)発現細胞数、筋幹細胞の中での増殖マーカー(Ki67)陽性細胞数をそれぞれ計測してみると、損傷させたSpar-/-マウスにおいて、野生型に比べ、それぞれの細胞数が上昇していることが明らかとなりました(Fig. 4)。しかし、これらSpar-/-マウスの結果は、ロイシン欠損飼料飼育によってキャンセルされてしまうこともわかりました(Fig. 4)。
今回の結果は、Non-cording RNAが翻訳するペプチドは、実はノイズではなく、機能があることを提示するものとなりました。どこのアミノ酸が実際には効いているのか、アミノ酸刺激とロイシン・アルギニン刺激の兼ね合いがどうなっているのか、あるいは損傷に応答したSPARの発現抑制は何によって制御されているのかなどについてはさらなる解析が必要と思われます。
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# by Fujii-group | 2017-10-27 11:05 | ラボミーティングの内容 | Comments(0)

シンガポールからの来学(N村日記)

9月28日、シンガポールのRepublic Polytechnic(School of Sports, Health & Leisure)から20名の学生がラボ見学に来られました。

日頃から国際サポーターとして英語でおもてなしをしている私にとって、1週間の日本滞在の中、日光や筑波大学に並んでヘルスプロモーション学域に来てくださるのはとても嬉しいことです。

そのようなわけで本企画の責任者を務めました。
・・・が、その役目は当日のおもてなしだけではありません!!
9月と言えば、首都大では一般的には夏休み期間。実は私には9月にシンガポール旅行の予定が入っていました✈︎。そこで、首都大でのラボ見学に先立ち、来訪予定学生さん(テレンスくん)にお願いして一緒にシンガポール観光をしてきました(*^o^*)

【ざっくり旅程】
ガーデンズバイザベイ(ドーム型植物園)
→オーチャードロード(日本でいう銀座みたいなところ)
→高島屋(スーパー目当て)
→中華料理屋(夜ご飯)
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その1週間後。Republic Polytechnicの学生さんたちが首都大に到着してからは、約1時間、ラボ紹介とラボツアーを行いました。ツアーは学部4年から修士2年まで、総出で手厚く行いました。

★ラボ紹介
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★ラボツアー
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来訪学生さんたちの興味、栄養学やスポーツ、スポーツマネジメントから派生した質問も多く出て、刺激的で新鮮な時間を過ごしました。
移動時間には藤井先生の研究室前の『RED SOX』とともに写真を撮ったり、他愛ない話もできました。
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互いの母国で会い、互いの友達、友達同士もお話でき🤝、心に残るイベントとなりました。

Republic Polytechnic, School of Sports, Health & Leisureの皆さん、ありがとうございました!(^o^)
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# by Fujii-group | 2017-10-05 20:59 | メンバーの日記 | Comments(0)

学生が聴いた科研費講習会 (M田日記)

先日行われたHPSのスポーツ大会で日頃の運動不足を実感したM田です。

今回は、眞鍋先生のご講演を含みました学内向け科研費講習会の報告です。
主には教員向けなのですが、予算獲得に向けた申請書等を書く際に自分にとっても参考になると思い参加させていただきました。いくつか、学生目線ではありますが印象に残った点を報告いたします。

1.採点・評価方法を知る!
必ず、評定基準を見ること!聞かれたことに答えること!
申請書の作成は、フィギュアスケートや体操競技に似ている。
例;転倒は-1点。演技後半のジャンプは基礎点が1.1倍。であるならば、後半に難易度の高めなジャンプを取り入れ、高得点を狙う演技構成で行く。
→申請書もどこを評価されるのか、何を聞かれているのかを確認する。これにより、減点を抑えて、高評価を維持できる。
審査基準を知らずに自己流で書いたところで評価されない。

2.簡単な文章で書くべし!
審査員は忙しいので、とにかく読みやすい文章を書くこと。幅広い分野の人に理解してもらえる文章であること。
短い文章で。
シンプルに。(~におけるXXを測定する系→~のXXの測定系)
「~のような」といったあいまいな表現は使わない。
漢字が多いのはNG!誤字・脱字もNG!

3.計画性・将来性がしっかりと示されていること!
文章は、簡単でありながらも具体的に計画が示されていること。
論理破綻していない。
上辺だけで方法を語っていない。(方法的に困難であれば、それを克服する方法を書く。書かないと理解していないとみなされる。)
研究の全体像が図で示されている。
年度ごとに行う内容がコピペのような内容でない。
研究体制が十分である。
計画内容に見合う業績がある。
研究経費がきちんと試算されている。
予備実験が行われている。
将来性が示されていること。
例;メンデルのエンドウ豆の交雑実験→良質なワインの作成方法につながる

4.厳しい意見をくれる人たちに見てもらうこと!
優しい人や年下の人は指摘が甘い場合があるかも。
2人以上に見てもらうこと。

5.書き出すタイミングに早過ぎということはない!

最近は、書店にも申請書の書き方に関するものがいくつかあるそうですので、一冊横に置いておくのが効果的だそうです。

以後、上記のようなことを意識して文章を書いていきたいと思います。

参考:
2017年度 首都大学東京
科研費講習会「若手研究、基盤研究(C)を例とした研究計画調書作成のコツ」


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# by Fujii-group | 2017-10-04 12:49 | メンバーの日記 | Comments(0)

体力医学会@松山の報告 (F市日記)

愛媛の松山で開催された体力医学会に参加してきました。
 出発前、地元が近い眞鍋先生に何を食べたら良いか聞くと「魚。鯛!」と即答されたので、松山に降り立ってすぐに「鯛塩ラーメン」を食べに行きました。夜はBarになるというこのお店(ニシキ イワモト)、おしゃれな雰囲気でありながらラーメンは本格的。スープは出汁の旨味が強くて、思わず飲み干してしまいました。
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 うちの娘は愛媛のゆるキャラ「みきゃん」が大好き。去年同じく松山で開催された別の学会では、みきゃんちゃんが会場に遊びに来てくれていたので、体力医学会でも・・・と期待していたのですが、残念ながら来られなかったようです。かわりに「みかん蛇口」がありました。蛇口を捻ればオレンジジュースが出るなんて何と素晴らしいことでしょうか。毎日楽しみました。
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 もちろん勉強もしっかりしてきました。金沢大学・増田先生オーガナイザーのミトコンドリアシンポジウムでは、僕の後輩の山田君(Johns Hopkins)が留学中の仕事を発表していました。ミトコンドリアは分裂・融合を繰り返して常に自己管理を行うことが分かってきましたが、彼は特に分裂の分子機序の一端を明らかにし、その生理作用を発表していました。次の演者の三浦先生(静岡県立大学)はミトコンドリア膜を構成する脂質の研究を発表されていました。膜脂質は今ラボのホットトピックの1つですので興味深く聴かせて頂きました。
 そのシンポジウムの同じ時間に別会場では、サルコペニアのシンポジウムで藤井先生の講演がありました。私たちが取り組んでいる培養細胞を用いた研究が披露され、大変反響がありました。発表の途中にはもちろんジョークもありました。僕はばっちり気づきましたが、会場の皆さんはどうだったでしょうか。
 僕もカルニチンをテーマとしたワークショップで講演させて頂きました。この研究を始めた大学院生の頃にとても真摯に相談に乗って下さった王堂先生(和洋女子大学)、以前から僕の研究に興味を持って下さり学会でいつも激励して下さった矢野先生(川崎医療福祉大学)とご一緒させて頂きました。10年ほど前、カルニチンはもう古い(実際に発見、機能解析されたのは100年以上前)とも言われたりしましたが、近年は再燃して、こうして表舞台に出てきたことは感慨深く思っています。
 今年の学会、2日目は台風直撃で大変でしたが、収穫は多かったです。ラボに持ち帰って今後の研究に活かしたいと思います。


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# by Fujii-group | 2017-09-25 09:22 | メンバーの日記 | Comments(0)

N村日記

8月28日午後8時からの「主治医が見つかる診療所」に藤井ラボが取り上げられました!放映日が決まってから実際に前振りが見られるまでドキドキしながら待ってました。スタジオにいる先生が「マイオカイン」を口にした時は舞い上がってました!

さて、内容です。
藤井先生は毎日自転車で通勤されていることを紹介(眞鍋先生、古市先生も毎日自転車通勤です)。文明の利器、電動自転車でも運動効果が発揮されることにはスタジオのタレントさんたちも驚きでした‼︎

中性脂肪改善のために日々どのようなことに気をつければ良いのか、ラクチン運動法を紹介、ということで研究室を超えた学生らは眞鍋先生に習ってエアロビクスをしました(^-^) 階段(1,2段でもok!)の上り下りを繰り返すステップエクササイズも紹介していました。

古市先生はご家族揃ってのテレビ出演。お子さんと遊ぶのは全身運動で、日々体を動かされています。

私たち学生の最大の出番は体育館で行ったエアロビクスでした。みんなお昼を食べ終わって着替えるとやる気満々で撮影を心待ちにしていました♪4年生は初めてのエアロビだったようでちょっと緊張気味だったかな…⁇ でも、エアロビなら初めてでも体を動かしやすいことが身をもって感じられたのではないでしょうか。
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やる気満々、映る気満々だった私たちは取材にも積極的に応えました!が、中々面白いことを言えず…次の機会には気の利いたことが言えるように鍛えておこうと思います!(笑)結局、放映で使われたのは青木さんでした。

自分の研究室がテレビに映るのはいつも不思議な感じがします。しかし、一般の方やテレビ局の方が注目したくなる研究を行っていることはとても誇りに思います。さらなるマイオカイン研究、そして日々のエアロビクス・運動に引き続き精進します!

放映を見てくださった方はぜひコメントなど宜しくお願いします!

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# by Fujii-group | 2017-09-01 19:35 | メンバーの日記 | Comments(0)