条件比較の実験を行う場合、同一dish上にControl群・実験群全てを「ランダムに」配置すること。

例えば、
*12 well dish
*Control群・Positive Control群・条件A群・条件B群の4条件を比較
*各群n-=3
の実験を考える場合、右のレイアウトでは実験結果がWellの位置による影響を排除できない。(Dishの端だとどの条件でも測定値が高めに出る場合など)

左のように『同じdish上に比較したい実験条件全て』が『ランダムに』乗るように配置することで、その影響を軽減することができる。
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by Fujii-group | 2014-11-22 17:30 | 実験のコツ(ミニコラム) | Comments(0)

F市先生の実験のコツ


「それってホントに収縮の影響? ーP-AMPKを見るための細胞回収方法ー」

当ラボでは、培養細胞を電気刺激で収縮させたときのシグナル伝達機構を解析している。
細胞内のエネルギーセンサーと呼ばれるAMPKは、収縮によってATPが消費されAMPが増加すると活性化(リン酸化)される。そのため、収縮強度の指標などにもよく使用されるが、それを正確に定量するのは練習が必要である。というのも、AMPKは低酸素などのストレスによっても活性化するため、培養液を取り除き細胞を刈り取るまでの間のんびりしていると、その間にリン酸化が増大してしまうからである。以降、当ラボに代々伝わるサンプリング方法を記載する。

◎用意する物(古市ラボノートの図参照)
・クラッシュアイスとステンレス製バット(底面を上)
・Nobu’s buffer(組成は藤井先生の論文参照)
・氷冷チューブ(サンプル数)
・セルリフター(サンプル数)
・連続分注器(500 µLにセット)
・洗面器(廃液入れ)
・ピペット、チップ、チップ捨て
・キムタオル
・タイマー

◎手順
・インキュベーターから細胞(角型4wellプレート)を取り出して、30秒間氷冷バットの上に乗せる。この間にNobu’s bufferを連続分注器で吸い上げる。
・(ここから急いで)培地をデカンタで洗面器に捨て、すかさずキムタオルに残った液を押しつけて取り除く。
・プレートをバットに戻し、すかさず連続分注器でNobu’s bufferを各wellにかける。
・セルリフターで細胞を掻き取り、bufferになじませる。流れるように全てのwellで行う。(ここまで急ぐ)
・刈り取った細胞はチューブに移して、ソニケーションにかける。

「培地を捨てて、阻害剤が入ったバッファーに混ぜるまで」をとにかく急ぐ(20秒くらい)。ここが遅いと、後のwellほどリン酸化が高まるので、コントロールと実験群はランダムに並べることが必要(BBCCではなく、BCCBなど)。

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by Fujii-group | 2014-10-20 19:50 | 実験のコツ(ミニコラム) | Comments(0)

M藤さんのコツ

当然なんだけど、出来ていない人も居るであろう・・・・
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今回は、マウスをDissectionして、各器官や組織からタンパク質を抽出する時のコツです。
プロテアーゼによるタンパク質の分解を防ぐために、
Dissection後は各器官や組織を速やかに液体窒素で凍結させる。
その後、Homogenizeしてタンパクを抽出する。
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by Fujii-group | 2014-10-18 09:44 | 実験のコツ(ミニコラム) | Comments(0)

ラボの覚書として、実験の気づいたコツを書いていくことにしました。実験をしていない人には何のことかわからないコツです。読み飛ばしてください・・・・。
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条件比較の実験を行う場合、必ず同一dish内にControl群・実験群全てをレイアウトした実験デザインを組むこと。

例えば、
*4well dish 2枚
*Control群・Positive Control群・条件A群・条件B群の4条件を比較
*各群n-=2
の実験デザインを考える場合、右のようなレイアウトではContorol群と条件A群or
B群の比較を行うことはできない。(実験結果の違いが、Dishの違いによる可能性を否定できないため。)

したがって、左のように『同じdish上に比較したい条件全て』が乗るように実験をデザインする必要がある。
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by Fujii-group | 2014-10-16 17:28 | 実験のコツ(ミニコラム) | Comments(0)